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Protein & Cell:TCF-1缺失會影響腸道微生物群的組成,並增加對結腸炎的易感性

發稿時間:2021-01-11來源:AG娱乐APP生物



腸道微生物群的多樣性和組成對於維持與哺乳動物健康相關的宿主共生細菌的內環境穩態起著關鍵作用。微生物群落紊亂與多種人類疾病的發病機製有關,如自身免疫性疾病、過敏、糖尿病、肥胖症和炎症性腸病(IBD),這顯然與患者和小鼠模型的腸道失調有關。近年來,免疫基因與宿主共生菌之間的相互作用以及宿主-菌群的共生機製引起了廣泛的研究興趣。腸道相關淋巴組織(GALTs)包括腸粘膜周圍的各種免疫細胞、腸粘膜派爾集合淋巴結(PPs)和腸係膜淋巴結(MLNs),是腸道免疫的關鍵。越來越多的研究表明,免疫基因通過與腸道相關淋巴組織(GALTs)缺失相關的先天性和適應性免疫臂來影響微生物群組成的穩定。Toll樣受體5通過介導REG3γ的產生,對鞭毛細菌的定殖起關鍵作用。先天性銜接子MyD88的缺失損害了T卵泡輔助細胞(Tfh)和產生IgAB細胞的發育,導致生發中心反應缺失而無法控製細菌群落。抑製性共受體程序性細胞死亡-1PD-1)缺失導致腸粘膜派爾集合淋巴結(PPs)生發中心產生IgAB細胞受損,造成微生物群落組成失衡。總之,GALTs免疫調節基因的缺失導致生發中心反應受損和IgA表達水平降低,這與腸道細菌群落失衡有關。眾所周知,轉錄因子TCF-1(由Tcf7編碼)在T細胞、NK細胞和ILCs的不同發育階段發揮重要作用,這些免疫亞群對於建立GALT和維持腸道相關免疫的平衡至關重要。新的研究表明,TCF-1在調節Tfh細胞的分化中也起著關鍵作用,Tfh細胞是幫助生發中心B細胞產生抗體的關鍵T細胞群。盡管TCF-1的這些重要功能已被闡明,但TCF-1與腸道細菌組成的關係仍不清楚。在這項研究中,我們的目的是破譯TCF-1在腸道微生物群落的穩態和炎症中的作用。



鑒於TCF-1GALTs的重要性,我們首先檢測了TCF-1缺失小鼠(Tcf7 −/− mice)和同窩對照小鼠的腸粘膜派爾集合淋巴結(PPs)和腸係膜淋巴結(MLNs)。與之前的報道類似,TCF-1缺失小鼠(Tcf7 −/− mice)由於發育異常而表現出不可見的PPs(圖1A),以及細胞數量減少的較小的MLN(圖1B)。下一步我們重點研究MLN中產生IgAB細胞亞群。在TCF-1缺失的MLNPNA+Fas+生發中心B細胞(GCBs)的頻率和細胞數顯著減少(圖S1)。盡管在Tcf7−/−小鼠中,CD138+CD19 lo漿細胞(PCs)的頻率在統計學上不顯著(圖S1C),但細胞數量顯著減少(圖S1D)。Tcf7 −/−小鼠糞便上清液中的IgA水平顯著降低(圖1C),相應地檢測到Tcf7 −/−小鼠腸道內容物的IgA結合微生物群顯著減少(圖1D)。這些數據表明,TCF-1的缺失導致MLNsGCBsPCs減少,IgA水平降低,這與腸道中IgA結合細菌的減少密切相關。這些數據表明,TCF-1的缺失導致MLNsGCBsPCs減少,IgA水平降低,這與腸道中IgA結合細菌的減少密切相關。


為了確定TCF-1的丟失是否影響細菌入侵過程中IgA的產生,我們用李斯特菌感染模型檢測了生發中心反應。在感染後第7天,對來自Tcf7−/−小鼠和同窩對照小鼠的TfhGCB細胞進行分析,我們發現Tcf7−/−小鼠的SPsMLNSLAM lo CXCR5+Tfh細胞的頻率和數量顯著減少(圖S2A),Tcf7−/−小鼠中的PD-1 hiCXCR5+GC Tfh細胞也表現出顯著減少(圖S2B)。同時,來自Tcf7−/−小鼠的SPMLN中的PNA+Fas+GCBactALM-Ova激發下顯著減少(圖S2C),因此,與對照組相比,Tcf7−/−小鼠的SPsMLNCD138+CD19 lo PC的頻率和數量也低得多(圖S2D)。免疫組化分析進一步證實了Tcf7−/−小鼠SPMLNB細胞濾泡內受損的PNA+GCs(圖S2E),結果,在沒有TCF-1的情況下,糞便中抗原特異性IgAIgG的水平顯著降低(圖S2F)。總之,這些結果表明TCF-1Tfh細胞的分化以及在急性細菌感染時產生抗原特異性IgA的生發中心反應是必需的。

考慮到年齡是建立穩定腸道細菌組成的關鍵因素,選擇5、1022周齡的小鼠進行16S擴增子測序分析。通過加權Unifrac距離的主坐標分析(PCoA),發現不同年齡的Tcf7−/−小鼠的微生物群落都明顯不同於其同窩對照組(圖1E)。5周齡和22周齡Tcf7−/−小鼠的微生物多樣性明顯減少,然而在10周齡的Tcf7−/−小鼠中,沒有統計學差異,盡管也表現出類似的趨勢(圖S3A)。與同窩對照組相比,Tcf7−/−小鼠的微生物群落中具有較多的Bacteroidetes和較少的Firmicutes(圖1F)。我們進一步利用LEfSe分析在對照組和Tcf7−/−小鼠中發現了幾個差異豐富的分支,例如,Tcf7−/−小鼠的促炎細菌(包括Prevotellaceae、Akkermansia、Enterococcus)水平升高,健康細菌(如Lactobacillus、Bifidobacterium)水平降低(圖S3BS3C)。此外,Tcf7−/−小鼠10周齡組在屬水平上,Bacteroides(在擬杆菌門中占優勢)增加,10周齡組和22周齡組在綱水平上,Bacilli(在厚壁菌門中占優勢)減少(圖1G)。為了檢測分類群的協同效應,分別使用5周齡、10周齡和22周齡組的數據分析了對照組和Tcf7−/−小鼠之間富集OTU的豐度相關網絡,正如預期的那樣,對照樣品中富集的OTUTcf7−/−小鼠富集的OTU呈負相關,這反映了Tcf7−/−小鼠腸道內容物中菌群的全部改變。同時,對照組或Tcf7−/−小鼠體內富集的OTU顯示出正相關(圖S3D)。我們的結果還表明,對照組和Tcf7−/−小鼠之間複雜性的改變與年齡有關。


為了評估基於腸道微生物群落多樣性變化的功能效應,使用16S擴增子測序數據進行KEGG途徑分析。22周齡組比5周齡或10周齡組有更多不同的途徑,特別是那些與免疫和感染相關的途徑,例如,在10周齡和22周齡的Tcf7-/-小鼠和對照組之間,傳染病的傳播途徑(PATH:ko09171)明顯不同,而在5周齡時則沒有。我們的結果表明,隨著年齡的增長,這些顯著的差異在不同的途徑中逐漸表現出來(圖S3E),一個可能的原因是宿主和微生物群在不同的遺傳環境中長期相互作用,建立了不同腸道微生物群組成的穩態;另一方麵,與年輕小鼠相比,老年小鼠的腸道功能有所下降,包括消化、營養吸收和免疫活性,這些綜合因素在老年TCF-1缺失組和對照組之間積累了更多的差異,這些發現為闡明不同年齡階段遺傳缺失宿主腸道菌群組成提供了新的思路。為了探索由於TCF-1缺失而引起的腸道菌群失衡和腸道炎症之間的相關性,我們用抗生素預處理的野生型小鼠從不同供體接收糞便建立了誘導性結腸炎模型,如流程圖所示(圖2A)。作為對照,我們首先通過硫酸葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導了Tcf7-/-小鼠或共同飼養的對照組的結腸炎模型,結果發現Tcf7-/-小鼠在DSS激發下表現出比其同居對照表現出更多的體重減輕和更嚴重的腸道炎症(圖2B2C,左圖)。與先前的研究一致,這些結果表明TCF-1缺失導致結腸炎的加重,然而,這些嚴重的結腸炎症狀並不僅僅源於腸道失調,因為腸道炎症與多種複雜因素有關。隨後,用抗生素預處理的野生型小鼠建立誘導性結腸炎模型,這些小鼠接受來自22周齡Tcf7−/−小鼠或共同飼養的對照組老鼠的糞便微生物群。我們發現,接受Tcf7-/-小鼠糞便的老鼠在DSS激發下比接受共同飼養的對照組糞便的老鼠體重減輕更多,症狀更嚴重(圖2B2C,右圖),接受Tcf7-/-小鼠糞便的老鼠的結腸比對照小鼠短(圖2D2E),因此,接受Tcf7-/--小鼠糞便微生物群的受體小鼠表現出更多的隱窩結構丟失和破壞性組織損傷(圖2F2G)。這些數據表明,與對照組相比,接受Tcf7−/−小鼠糞便微生物群的受體小鼠發生了更嚴重的結腸炎症,並且TCF-1缺失導致的腸道微生物群失調是DSS激發增強腸道炎症的一個不可或缺的因素。

總之,使用不同年齡階段的Tcf7−/−小鼠來評估TCF-1在腸道微生物群中的作用,並且16S rRNA擴增子測序數據反映了Tcf7−/−小鼠腸道細菌群落組成的紊亂。與同窩對照組相比,TCF-1缺失小鼠的PPs不明顯,MLN變小,與生發中心反應缺失相關的GCB減少,從而導致IgA產生缺失和IgA結合細菌減少。因此,Tcf7−/−小鼠腸道細菌群落的失調與年齡有關,並有助於促進結腸炎症。因此,我們的結果揭示了以前未知的TCF-1在維持腸道菌群內穩態中的作用,並證明TCF-1缺失是導致腸道炎症的一個危險因素,對臨床試驗具有潛在的意義。


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