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【昊閱讀】甲基化芯片組學篩查後,到底怎麽驗證?

發稿時間:2021-01-21來源:AG娱乐APP生物

相信不少研究表觀遺傳學的小夥伴在進行甲基化組學芯片篩查後,都麵臨一個艱難選擇,到底選什麽位點去驗證呢?

其實很多已發表文章都為大家提供了答案。今天小編就來帶大家讀讀幾篇甲基化研究文章(部分是AG娱乐APP客戶的文章),看看候選位點的篩選有哪些策略可以讓我們參考。


英文題目:Genome-wide DNA methylation analysis in systemic sclerosis revealshypomethylation of interferon-associated genes in CD4+ and CD8+ T cells

中文題目:全基因組DNA甲基化研究發現係統性硬化症患者CD4+ 和CD8+ T細胞的幹擾素相關基因表現低甲基化狀態

期刊名:《J Invest Dermatol.》    

發表時間:2017年12月05日    

影響因子:7.143

單位:上海複旦大學生科院王久存教授課題組

研究方法:

                    

甲基化候選位點的篩選方式

    1)針對芯片檢測獲得的差異甲基化位點,進行通路富集分析,發現type I IFN signaling pathway 在2種細胞類型中都顯著富集: CD4+ (P = 7.59 × 10-6); CD8+ (P = 2.10 × 10-8)


2)在通路中基於P值和基因功能,篩選了16個基因,對對應的62個差異甲基化位點進行大樣本驗證。

3)基於這62個差異甲基化位點進行目標區域擴增和目的區域甲基化二代測序(AG娱乐APPMethyltarget檢測)大樣本驗證,其中57個位點成功被檢測,同時二代測序又獲得了周圍154個CpG位點的甲基化數據。驗證成功的位點集中在5個IFN相關基因。

4)因為有57個位點既采取了芯片檢測,又進行了基於二代測序的Methyltarget驗證,因此針對overlap樣本進行了技術一致性分析,R2值達到0.88.

5)針對5個驗證成功的基因進行甲基化-mRNA表達水平驗證,基因的甲基化水平為基因上所有CpG甲基化水平的第一主成分。

6) 針對5個驗證成功的基因,進行甲基化、表達與血清 type I IFN-a/b 蛋白水平的關聯分析

英文題目:Rheumatoid arthritis–associated DNA methylation sites in peripheral blood mononuclear cells

中文題目:外周血單核細胞中類風濕性關節炎相關的DNA甲基化位點

期刊名:《Annals of the Rheumatic Diseases》    

發表時間:2017年12月05日   

 影響因子:16.102

單位:蘇州大學


  • 甲基化候選位點的篩選方式

1)甲基化芯片共鑒定了1046 個差異甲基化位點 (DMPs) (|Δβ|>0.05 + p<0.05), 其中730 個DMPs 位於598個基因。


2)在這598個基因中,445個基因 (覆蓋 540 DMPs) 有表達數據。相關性分析得出,有107個DMP和 91個基因的表達水平存在相關性 (p<0.05) (正相關:負相關=44:63). 其中的67個基因 (覆蓋81DMPs)在組間存在差異表達(p<0.05)。

3)針對上文提到的445個DMGs,,分別進行基於STRING的蛋白互作分析,在91個 DMGs 和67 個 DMGs 的互作分析結果中,都檢測到了interferon-inducible gene interaction subnetwork這一網絡(下圖A). 進一步基於Cytoscape,針對81個DMPs和67個相應的基因mRNA的表達數據進行共表達整合網絡分析,確定了5個亞網絡(其中b4,b5同時包括了甲基化和表達數據)。基於這部分分析,鑒定了幾個hub gene:MX1, IFI44L, DTX3L and PARP9。

4)基於上述結果,選擇10個DMGs:PARP9, IFI44L, MX1, ISG15, FAM8A1, STK17A, BLK, CNPY1, CBX7and SLC7A14 進行差異甲基化和差異表達的獨立樣本驗證。選擇條件為:(ⅰ) DMP位於啟動子, (ⅱ) DMP的甲基化水平與基因表達水平顯著相關, (ⅲ) DMP 上下遊300bp的CpG位點豐富 (如:目標區域至少有3個CpG位點), (ⅳ) 基因屬於通路分析中鑒定出來的優先選擇.

5)針對10個DMG,共檢測了15個DNA片段(100–300 bp) 。5個在獨立樣本驗證成功的DMPs ,有三個位於PARP9基因(cg00959259, cg08122652, cg22930808) 。10個基因在獨立樣本中,有6個存在差異表達,其中4個基因和發現階段趨勢也一致(BLKIFI44LMX1 and PARP9) 。

6)後續選定PARP9基因進行後麵的功能驗證。

Nat Commun (IF: 12.121). 2017 Feb 1;8:14053. doi:10.1038/ncomms14053.HOPX Hypermethylation Promotes Metastasis via Activating SNAIL Transcription in Nasopharyngeal Carcinoma


  • 甲基化候選位點的篩選方式

1)確定差異DMP和關注的基因: P<0.05 and Δβ change ≥|0.2|。隻選擇轉錄因子啟動子區(TSS and 5′-UTR)的CpG位點進行分析,TFs的查詢網站 (http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/)2)在344 TFs 中確定1,984 個差異CpG sites。其中 HOPX (cg21899596) 為甲基化水平改變最大的cpg位點。


2)在344 TFs 中確定1,984 個差異CpG sites。其中 HOPX (cg21899596) 為甲基化水平改變最大的cpg位點。

3)獨立樣本驗證HOPX 基因啟動子區的CpG島區甲基化情況(下圖為驗證區域),確定HOPX 基因啟動子在癌組織和癌症細胞係中都高甲基化。

4)  驗證表達水平和HOPX 基因啟動子區甲基化的相關性。

5) HOPX 基因的功能研究。



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