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轉錄組測序+SSR鑒定,文章可以輕鬆發

發稿時間:2021-01-25來源:AG娱乐APP生物

題目:The development of SSR markers based on RNA-sequencing and its validation between and within Carex L. species基於RNA測序的SSR標記的開發及其在苔草種間和種內的驗證

發表期刊:BMC Plant Biol.   

發表時間:2021-1-6  

影響因子:3.497

苔草屬(Carex L.)是莎草科最大的屬之一,也是生態係統中重要的維管植物。但苔草的遺傳背景複雜,分類不明確。為了研究苔草的基因功能注釋,進行了RNA-seq分析。根據Illumina的測序數據生成SSR,然後用於研究79份苔草種質的遺傳特性。在本研究中,共獲得36,403個單基因,總長度為41,724,615 bp,並基於GO、KOG、KEGG、NR數據庫進行注釋。在8776SSR中,隨機選擇了96對引物。42對多態性較高的引物共擴增出180條多態性帶。每個引物的平均條帶數為4.3,平均距離值為0.548,多態信息含量為0.133-0.494。觀察到的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei's基因多樣性(H)Shannon信息指數分別為2.000、1.376、0.2430.391。NJ聚類分為三組,來自新西蘭的材料表現出相似的遺傳屬性,聚類成一組。UPGMAPCoA分析也顯示了相同的結果。AMOVA分析表明,基於地理起源聚類和NJ聚類的種內遺傳多樣性優於種間遺傳多樣性。此外,本研究還建立了79種苔草的指紋圖譜。引物對的不同組合可以一次鑒定多種苔草,克服了傳統鑒定方法的困難。轉錄組分析從基因注釋中揭示了新的功能類別。遺傳特征分析表明,79種苔草屬植物間存在廣泛的基因流動。這些標記可用於調查苔草和相關物種的進化史,以及作為未來育種項目的指南。

使用HiSeq2000平台進行轉錄組測序,利用TRINITY、TGICL等軟件進行從頭組裝和功能注釋,使用MISA和Primer等軟件SSR的鑒定和引物設計,用POPGENE進行遺傳多樣性分析,使用NTSYS、PowerMarke、MEGA和GenAlEx等軟件對79份材料進行聚類分析和AMOVA等分析。

RNA-seq及從頭組裝

使用HiSeq2000平台對青綠苔草的轉錄組進行測序。總共獲得了43.67Gb的數據。每個樣本的數據達到6.32Gb,Q30百分比超過94.03%。總共有36,403個單基因,其中12,657個單基因的長度超過1 kb。單基因的N502016,表明具有很高的組裝完整性。

基於不同數據庫的基因注釋

根據序列的同源性分析,將11,629個單基因(31.95%)分為三個主要的GO類和50個子類。根據KOG數據庫,將11,871個單基因分為25個功能組,並將20.52%的單基因注釋為“一般功能”群。基於KEGG數據庫,總共發現了8440個單基因,包括屬於五個大類(細胞過程,遺傳信息處理,環境信息處理,代謝和生物係統)的40條生物途徑(圖1)。

基於NCBI非冗餘核苷酸數據庫,E值分布顯示有23.00%的單基因搜索到結果(2a),約35.00%的單基因表現出大於80%的同一性(2b)。NR蛋白序列比對結果顯示,21.69%可與菠蘿屬植物比對,10.10%可與杜鵑花屬植物比對,8.03%可與鳳凰屬植物比對(2c)。

轉錄組中SSR的頻率和分布

使用MISA軟件共掃描了36,403個單基因,檢測到8776SSR位點(1)。轉錄組中的SSR位點有六種類型,每種重複類型的數量差異很大。

SSR的開發及評價

我們設計並合成了96對引物來擴增11個表型差異材料,其中42(43.75%)可擴增多條條帶,多態性高。引物表明不同苔草屬物種之間具有良好的可轉移性。未擴增條帶數占15.6%,其餘多態性較低或無多態性。
遺傳多樣性統計

42SSR中,我們識別了79份材料中的180個標記等位基因。42SSR中,PIC值在0.133 ~ 0.494之間,平均為0.259。SSR在不同材料間表現出較大的遺傳變異。采用聚類分析、主成分分析對苔草材料間的遺傳多樣性進行了研究。平均每個引物擴增出4.3條引物。觀察到的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei(1973)基因多樣性(H)Shannon信息指數(I)分別為2.000、1.376、0.2430.391,表明苔草種間的遺傳多樣性較高。
基於SSR標記的苔草屬植物聚類分析

為了揭示苔草屬物種的分類信息,我們根據原始數據獲得了等位基因頻率。我們使用NJ、PCoAUPGMA聚類分析,而不是使用種源或分類等先驗分類,並結合這些結果來探索所有材料的遺傳信息和分類。
主坐標分析(PCoA)結果得到了兩組遺傳分化的苔草屬材料(4)。第一主成分占29.6%,第二主成分占19.8%。

4、苔草屬79種樣本的PCoA分析。第一主成分占29.6%,第二主成分占19.8%。紅色菱形代表中國的種質資源,綠色正方形代表新西蘭的種質資源,藍色三角形代表北美的種質資源,黃色圓圈代表德國的種質資源。


基於Shered等位基因距離計算方法,NJ係統發育分析將79份苔草屬植物資源分為3(5)。


SSR原始數據的基礎上,采用Dice係數法計算相似度。采用UPGMA法對79份材料進行聚類分析(6)。基因型間的相似度為0.070 ~ 0.786。通過UPGMA聚類,將79份種質資源分為兩大類。關於苔草的收集來源,中國與新西蘭、德國和北美的苔草種質之間存在一定程度的基因交換。然而,總的來說,資源不能完全按地區分配。相關係數r = 0.941,表明聚類結果可靠。

為了評估這些種質之間的遺傳差異,我們計算了所有材料對之間的FST值。通過不同來源的分析,AMOVA表明79份材料的總遺傳變異中88%在群體內,12%在群體間。AMOVA分析結果顯示,部分亞種在國家間存在較大差異,這與上述不同國家材料的結果一致。而基於NJ聚類分析的AMOVA分析結果顯示89%在人群內(2)。

轉錄組分析為注釋基因的功能分類提供了新的思路,並將有助於未來基因功能研究。遺傳背景分析表明,基因流在79苔草物種中廣泛存在。這些標記物可用於評估遺傳多樣性,並研究苔草和相關物種的進化史,以及在將來的育種項目中提供指導。


AG娱乐APP生物具有豐富的轉錄組測序分析和SSR檢測經驗,我們致力於為研究者提供“一站式”高質量的科研策略谘詢、實驗技術服務和遺傳數據分析服務,期待成為大家科研工作中的“昊”助手與“昊”夥伴。歡迎聯係我們具體谘詢!
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